快速實(shí)時(shí)的PCR檢測(cè)---賽多利斯實(shí)驗(yàn)室

支原體是世界上最小的能夠獨(dú)立繁殖的細(xì)菌之一。它們屬于柔膜細(xì)菌目（Mollicutes），具有非常緩慢的寄生生長(zhǎng)方式。支原體可引起動(dòng)物和植物體內(nèi)的眾多感染現(xiàn)象。

快速實(shí)時(shí)的PCR檢測(cè)

用于支原體DNA敏感檢測(cè)的實(shí)時(shí)PCR技術(shù)

本文以使用Vivaspin® 20 超濾管進(jìn)行DNA分離，用Microsart® AMP進(jìn)行支原體檢測(cè)為例�；�于PCR的檢測(cè)試劑盒為用戶提供可靠、穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果，耗時(shí)只需3小時(shí)，該方法簡(jiǎn)易且經(jīng)濟(jì)、即取即用、靈敏度高。

支原體沒有細(xì)菌所具有的細(xì)胞壁，也就沒有抗體的攻擊點(diǎn)，因而非常難以控制。鑒于此，使用傳統(tǒng)的除菌過(guò)濾器（0.2μm孔徑）對(duì)支原體實(shí)現(xiàn)完全截留。不可忽視的是，支原體的細(xì)胞大小為0.5-0.8μm，同時(shí)具有極大的靈活性和變形能力，能夠通過(guò)除菌濾器。

支原體檢測(cè)

檢測(cè)支原體污染的方法有許多種。以生長(zhǎng)法舉例，在特定液體或固體的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，或通過(guò)熒光顯微鏡的方式進(jìn)行檢測(cè)等都是非常普遍的方法。在目前的“金標(biāo)準(zhǔn)”里，生長(zhǎng)檢測(cè)需要至少有28天的培養(yǎng)時(shí)間，然后使用這些可用排除法確定并且緩慢生長(zhǎng)的細(xì)菌進(jìn)行污染。在此階段中，樣品必須要在白天可肉眼檢測(cè)，而這也需要大量的時(shí)間。

即使采用熒光顯微鏡進(jìn)行輔助檢測(cè)，依然需要至少8天的時(shí)間來(lái)排除鑒定支原體的感染。另外，操作者需要經(jīng)過(guò)專門培訓(xùn)，擁有豐富的經(jīng)驗(yàn)，并知道特殊知識(shí)，才可有能力排除對(duì)結(jié)果的干擾。

“3-小時(shí)”替代法

基于PCR的檢測(cè)試劑盒（如賽多利斯公司的Microsart®  AMP支原體試劑盒）可為用戶提供靈敏、穩(wěn)定的檢測(cè)結(jié)果，耗時(shí)只需3小時(shí)。該方法簡(jiǎn)易且經(jīng)濟(jì)、試劑盒即取即用。試劑盒上僅需要一個(gè)能夠檢測(cè)熒光染料FAM和ROX的實(shí)時(shí)PCR儀即可。該P(yáng)CR試劑盒適用于各種各樣的初始樣品。配合使用Vivaspin® 20或Vivaspin® 6超濾管，則可處理高達(dá)18ml的樣品體積，從而確保高的靈敏度。
實(shí)驗(yàn)部分

下面所述的是一個(gè)使用Vivaspin® 20超濾管進(jìn)行DNA分離并用Microsart® AMP進(jìn)行支原體檢測(cè)的案例。

將Mycoplasma fermentans于37℃在Hayflick培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，直至酚紅指示劑顏色發(fā)生輕微的改變，然后將其用1xPBS（磷酸鹽緩沖液）以1:1000的比例進(jìn)行稀釋。用移液器將18ml的稀釋樣品平均加入至每個(gè)Vivaspin® 20超濾管。為了中和非特異性化合物，在每份樣品中添加2ml的包被緩沖液。然后以3500x g的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，直至濃縮后的剩余體積約為200μl。在200μl裂解緩沖液的協(xié)助下，將全部濃縮物轉(zhuǎn)移至一支新的1.5ml反應(yīng)管中。緩沖液是用于沖洗Vivaspin® 20超濾管，以確保樣品被完全徹底地轉(zhuǎn)移。將200μl濃縮樣品和200μl裂解緩沖液組成的混合物在56℃孵育15分鐘，以促使細(xì)胞完全裂解。在該步驟之后，使用濃縮管將DNA分離。在DNA分離過(guò)程中，采用Microsart® AMP提取試劑盒，并根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。幾乎全部分離的DNA都要用于實(shí)時(shí)PCR（60μlDNA洗脫液中的50μl），以達(dá)到最大的敏感度。

平行測(cè)試中，在不經(jīng)過(guò)Vivaspin® 濃縮步驟的情況下，取相同初始量的DNA進(jìn)行分離，以對(duì)經(jīng)過(guò)濃縮和未經(jīng)過(guò)濃縮的樣品進(jìn)行直接對(duì)比。

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書操作，PCR反應(yīng)步驟如下：

 

l 將試劑盒中反應(yīng)管與凍干成分一起以最大速度離心5秒，將1275μl的緩沖液添加至引物/探針/核苷酸混合物（紅帽）中。

 

l 將300μl水（PCR質(zhì)量級(jí)別）添加至陽(yáng)性對(duì)照（綠帽）和內(nèi)參對(duì)照（黃帽）中。

 

l 在室溫下孵育5分鐘，直至完全混合。

 

l 將溶液和Vortex混合物簡(jiǎn)單混合，并快速離心。

 

l 主混合物（Master Mix）的組成：每次均將49μl的引物/探針/核苷酸混合物（紅帽）和1μl的內(nèi)參對(duì)照（黃帽）進(jìn)行反應(yīng)，移液并混合至一支1.5ml的反應(yīng)離心管中。

 

將50μl主混合物和50μl樣品或陽(yáng)性對(duì)照或陰性對(duì)照液（比如：洗脫緩沖液，PCR水，或者10mM Tris緩沖液）移液至200μl的PCR管中，并插入至經(jīng)過(guò)預(yù)設(shè)程序的實(shí)施熱循環(huán)儀中。

將濃縮樣品的Ct值（循環(huán)閾值）與未濃縮樣品持續(xù)進(jìn)行比較。Ct值是當(dāng)熒光信號(hào)達(dá)到某個(gè)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。表1列出了每一個(gè)Ct值。表2所示的是平均ΔCt值，即表1和使用或者未使用包被緩沖液樣品之間的Ct值之差。ΔCt值的測(cè)定為：ΔCt-Ct（未經(jīng)Vivaspin濃縮的樣品）-Ct（濃縮樣品）。

 

與包被緩沖液一起進(jìn)行共同濃縮后，Mycoplasma fermentans可達(dá)到ΔCt>7的Ct差值。當(dāng)沒有使用包被緩沖液（個(gè)值未列出）時(shí)，記錄的ΔCt值為稍低一點(diǎn)的6，盡管這一結(jié)果可能是由于Vivaspin® 超濾管的離心時(shí)間更短而造成的。不過(guò)，它仍然顯示了在靈敏度上有了顯著的提高。

 

靈敏度以及時(shí)間等參數(shù)對(duì)于支原體污染的調(diào)查而言是至關(guān)重要的。在濃縮步驟中，這些參數(shù)在PCR試劑盒中都會(huì)有詳細(xì)描述。通過(guò)使用Vivaspin® 20，Ct值可提高到ΔCt>7，相應(yīng)的靈敏度可以增加大約2 log的水平。這使得Microsart® AMP檢測(cè)試劑盒和Vivaspin® 20能夠成為經(jīng)濟(jì)、有效又實(shí)用的快速支原體檢測(cè)工具

實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

使用TaqMan® 探針進(jìn)行實(shí)時(shí) qPCR 能夠檢測(cè)支原體的DNA，起始體積 200 μl -18 ml。通過(guò)qPCR 循環(huán)對(duì)樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)軟件系統(tǒng)得到試驗(yàn)結(jié)果。