上個世紀(jì)初，科學(xué)家們認(rèn)為蛋白質(zhì)是生命體的遺傳物質(zhì)，而具有獨特的作用。隨著這個理論被證偽，真正的遺傳物質(zhì)DNA的結(jié)構(gòu)被給予了很大關(guān)注。然而，蛋白質(zhì)作為生命體的重要大分子，其重要性也從未被忽視，而且在1950年代開始，科學(xué)家一直在探尋DNA序列和蛋白質(zhì)序列的相關(guān)性。與此同時，蛋白質(zhì)測序和結(jié)構(gòu)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的努力開始慢慢獲得回報。更多的生化研究揭示了蛋白質(zhì)的功能重要性，因此蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的解析對于深入理解蛋白質(zhì)功能和生理現(xiàn)象起著決定性作用。

　　蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析六十年來大事件

　　在1958年，英國科學(xué)家John Kendrew和Max Perutz首先發(fā)表了用X射線衍射得到的高分辨率的肌紅蛋白Myoglobin的三維結(jié)構(gòu)，然后是更加復(fù)雜的血紅蛋白Hemoglobin。因此，這兩個科學(xué)家分享了1962年的諾貝爾化學(xué)獎。事實上，這項工作在早在1937年就開始了。

　　然后在1960年代，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析方法不斷進(jìn)步，獲得了更高的解析精度。這個時期，蛋白質(zhì)序列和DNA序列間關(guān)系也被發(fā)現(xiàn)，中心法則被Francis Crick提出，然后科學(xué)界見證了分子生物學(xué)的崛起。分子生物學(xué)(Molecular Biology)的名稱在1962年開始被廣泛接受和使用，并逐漸演變出一些支派，如結(jié)構(gòu)生物學(xué)。然后在1964年，Aaron Klug提出了一種基于X射線衍射原理發(fā)展而來的全新的方法電子晶體學(xué)顯微鏡(crystallographic electron microscopy )，可以解析更大蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)核酸復(fù)合體結(jié)構(gòu)。因為這項研究，他獲得了1982諾貝爾化學(xué)獎。1969年，Benno P. Schoenborn 提出可以用中子散射和原子核散射來確定大分子中固定位置的氫原子坐標(biāo)。

　　進(jìn)入1970年代，很多新的方法開始發(fā)展。存儲蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的Protein Data Bank(1971年) 開始出現(xiàn)，這對于規(guī)范化和積累蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)有著重要意義。1975年新的一種儀器叫做多絲區(qū)域檢測器，讓X-ray的檢測和數(shù)據(jù)收集更加快速高效。次年，Robert Langride將X-ray衍射數(shù)據(jù)可視化，并在加州大學(xué)圣地亞哥分校成立了一個計算機(jī)圖形實驗室。同年，KeithHodgson和同事首次證明了可以使用同步加速器獲得的X射線并對單個晶體進(jìn)行照射，并取得了很好的實驗效果。然后在1978年，核磁共振NMR首次被用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析;同年首個高精度病毒(西紅柿叢矮病毒)衣殼蛋白結(jié)構(gòu)被解析。

　　在1980年代，更多蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被解析，蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的描述越來越成熟，而且蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析也被公認(rèn)成為藥物研發(fā)的關(guān)鍵步驟。在1983年，冷凍蝕刻的煙草花葉病毒結(jié)構(gòu)在電子顯微鏡結(jié)構(gòu)下得到描述。兩年后德國科學(xué)家John Deisenhofer等解析出了細(xì)菌光合反應(yīng)中心，因此他們共享了1988年的諾貝爾化學(xué)獎。次年，兩個課題組解析了HIV與復(fù)制相關(guān)的蛋白酶結(jié)構(gòu)，對針對HIV的藥物研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

　　下一個十年，因為大量同步加速器輔助的X射線衍射的使用，數(shù)千個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得到解析，迎來了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組的曙光。1990年多波長反常散射方法(MAD)方法用于X射線衍射晶體成像，與同步輻射加速器一起，成為了近二十多年來的最常用的的方法。Rod MacKinnon在199年發(fā)表了第一個高精度的鉀離子通道蛋白結(jié)構(gòu)，對加深神經(jīng)科學(xué)的理解起了重要作用，因此他分享了2003年的諾貝爾化學(xué)獎。Ada Yonath等領(lǐng)導(dǎo)的課題組在1999年首次解析了核糖體結(jié)構(gòu)(一種巨大的RNA蛋白質(zhì)復(fù)合體)。

　　進(jìn)入新千年，更多的技術(shù)細(xì)節(jié)被加入到蛋白質(zhì)解析研究領(lǐng)域。2001年，Roger Kornberg和同事們描述了第一個高精度的RNA聚合酶三維結(jié)構(gòu)，正因此五年后他們共享了諾貝爾化學(xué)獎。2007年，首個G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)的解析更是對藥物研究帶了新的希望。近些年來，越來越多的大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得到解析。Cryo-EM超低溫電子顯微鏡成像用于超大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)成像的研究日益成熟，并開始廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析。

　　蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的常用實驗方法

　　1.X-ray衍射晶體學(xué)成像

　　X射線衍射晶體學(xué)是最早用于結(jié)構(gòu)解析的實驗方法之一。X射線是一種高能短波長的電磁波(本質(zhì)上屬于光子束)，被德國科學(xué)家倫琴發(fā)現(xiàn)，故又被稱為倫琴射線。理論和實驗都證明了，當(dāng)X射線打擊在分子晶體顆粒上的時候，X射線會發(fā)生衍射效應(yīng)，通過探測器收集這些衍射信號，可以了解晶體中電子密度的分布，再據(jù)此析獲得粒子的位置信息。利用這種特點，布拉格父子研制出了X射線分光計并測定了一些鹽晶體的結(jié)構(gòu)和金剛石結(jié)構(gòu)。首個DNA結(jié)構(gòu)的解析便是利用X射線衍射晶體學(xué)獲得的。

　　后來，獲得X射線來源的技術(shù)得到了改進(jìn)，如今更多地使用同步輻射的X射線源。來自同步輻射的X射線源可以調(diào)節(jié)射線的波長和很高的亮度，結(jié)合多波長反常散射技術(shù)，可以獲得更高精度的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，也成為了當(dāng)今主流的X射線晶體成像學(xué)方法。由X射線衍射晶體學(xué)解析的結(jié)構(gòu)在RCSB Protein Data Bank中占到了88%。

　　X射線衍射成像雖然得到了長足的發(fā)展，仍然有著一定的缺點。X射線對晶體樣本有著很大的損傷，因此常用低溫液氮環(huán)境來保護(hù)生物大分子晶體，但是這種情況下的晶體周圍環(huán)境非常惡劣，可能會對晶體產(chǎn)生不良影響。而且，X射線衍射方法不能用來解析較大的蛋白質(zhì)。

　　2.NMR核磁共振成像

　　核磁共振成像NMR全稱Nuclear magnetic resonance，最早在1938被Isidor Rabi (1946年諾貝爾獎)描述，在上世紀(jì)的后半葉得到了長足發(fā)展。其基本理論是，帶有孤對電子的原子核(自選量子數(shù)為1)在外界磁場影響下，會導(dǎo)致原子核的能級發(fā)生塞曼分裂，吸收并釋放電磁輻射，即產(chǎn)生共振頻譜。這種共振電磁輻射的頻率與所處磁場強(qiáng)度成一定比例。利用這種特性，通過分析特定原子釋放的電磁輻射結(jié)合外加磁場分別，可以用于生物大分子的成像或者其他領(lǐng)域的成像。有些時候，NMR也可以結(jié)合其他的實驗方法，比如液相色譜或者質(zhì)譜等。

　　RCSB Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫中存在大約11000個用NMR解析的生物大分子結(jié)構(gòu)，占到總數(shù)大約10%的結(jié)構(gòu)。NMR結(jié)構(gòu)解析多是在溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，一般認(rèn)為比起晶體結(jié)構(gòu)能夠描述生物大分子在細(xì)胞內(nèi)真實結(jié)構(gòu)。而且，NMR結(jié)構(gòu)解析能夠獲得氫原子的結(jié)構(gòu)位置。然而，NMR也并非萬能，有時候也會因為蛋白質(zhì)在溶液中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定能難得獲取穩(wěn)定的信號，因此，往往借助計算機(jī)建模或者其他方法完善結(jié)構(gòu)解析流程。

　　使用NMR解析的血紅蛋白結(jié)構(gòu)建模(圖片來源RCSB PDB)

　　3.Cryo-EM超低溫電子顯微鏡成像

　　電子顯微鏡最早出現(xiàn)在1931年，從設(shè)計之初就是為了試圖獲得高分辨率的病毒圖像。通過電子束打擊樣本獲得電子的反射而獲取樣本的圖像。而圖像的分辨率與電子束的速度和入射角度相關(guān)。通過加速的電子束照射特殊處理過的樣品表明，電子束反射，并被探測器接收，并成像從而獲得圖像信息。具體做法是，將樣品迅速至于超低溫(液氮環(huán)境)下并固定在很薄的乙烷(或者水中)，并置于樣品池，在電子顯微鏡下成像。圖像獲得后，通過分析圖像中數(shù)量眾多的同一種蛋白質(zhì)在不同角度的形狀，進(jìn)行多次的計算機(jī)建模從而可以獲得近原子級別的精度(最低可以到2.0埃)。

　　Cyro-EM解析TRPV1離子通道蛋白(圖片來源Structure of the TRPV1 ion channel )

　　將電子顯微鏡和計算機(jī)建模成像結(jié)合在一起的大量實踐還是在新世紀(jì)之后開始流行的。隨著捕捉電子的探測器技術(shù)(CCD技術(shù)，以及后來的高精度電子捕捉、電子計數(shù)electron counting設(shè)備)的提升，更多的信息和更低的噪音保證了高分辨率的圖像。

　　近些年來，Cryo-EM被用來解析很多結(jié)構(gòu)非常大(無法用X-ray解析)的蛋白質(zhì)(或者蛋白質(zhì)復(fù)合體)，取得了非常好的結(jié)果。同時，單電子捕捉技術(shù)取代之前的光電轉(zhuǎn)換成像的CCD攝像設(shè)備，減少了圖像中的噪音和信號衰減，同時并增強(qiáng)了信號。計算機(jī)成像技術(shù)的成熟和進(jìn)步，也賦予了Cryo-EM更多的進(jìn)步空間。然而，Cyro-EM與X-ray不同，該方法不需要蛋白質(zhì)成為晶體，相同的是都需要低溫環(huán)境來減少粒子束對樣品的損害。

　　除去介紹的這三種方法以外，計算機(jī)建模技術(shù)也越來越多地被用在了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中。而且新解析的結(jié)構(gòu)也會提高計算機(jī)建模的精確度。未來，我們或許能夠用計算機(jī)構(gòu)建原子級別的細(xì)胞模型，構(gòu)建在芯片上的細(xì)胞。

　　蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對了解生命體的生化反應(yīng)、有針對性的藥物研發(fā)有著重要意義。從1958到如今已經(jīng)接近60年，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析得到了較快的發(fā)展。然而，在如今DNA測序如此高效廉價的時代，蛋白質(zhì)和DNA結(jié)構(gòu)解析并沒有進(jìn)入真正高速發(fā)展階段，這也導(dǎo)致了在如此多的DNA序列數(shù)據(jù)非常的今天，結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)卻相對少的可憐。大數(shù)據(jù)時代的基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組、脂類組等飛速發(fā)展的時候，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組也得到了更加廣泛的重視。發(fā)展高精度、高效的結(jié)構(gòu)解析技術(shù)也一直都有著重要意義。未來，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析，對針對蛋白質(zhì)的藥物篩選，和計算機(jī)輔助的藥物研究研究不應(yīng)被低估。未來說不定在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)領(lǐng)域有著更多驚喜，我們拭目以待。