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分光光度計的原理及使用注意事項

[2017/5/27]

分光光度計是實驗室常規(guī)分析設(shè)備,主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、信號處理器和顯示與存儲系統(tǒng)組成。它利用光譜分析方法對樣品進行定性、定量分析,在現(xiàn)代分子生物實驗室中常用于核酸,蛋白定量以及細菌生長濃度的定量等。分光光度計又稱光譜儀(spectrometer),是采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源,通過系列分光裝置,從而產(chǎn)生特定波長的光源,光源透過測試的樣品后,部分光源被吸收,計算樣品的吸光值,從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。測量范圍一般包括波長范圍為380~780 nm的可見光區(qū)和波長范圍為200~380 nm的紫外光區(qū)。不同的光源都有其特有的發(fā)射光譜,因此可采用不同的發(fā)光體作為儀器的光源。

核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。

蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)
這種方法是在280nm波長直接測試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應(yīng)的換算方法,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。該方法適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說,速度快,操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。

比色法蛋白質(zhì)定量
比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨
基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。

細菌細胞密度(OD 600)
OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液,之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作,必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進行細胞計數(shù),做出校正曲線。需要注意的是,測試的樣品不能離心,保持細菌懸浮狀態(tài)。

分光光度計屬于精密儀器,應(yīng)當(dāng)妥善保管和精心維護,這樣才能保證分光光度計長期使用、長期的穩(wěn)定可靠、測量精度高。

分光光度計使用注意事項
1. 使用儀器前,使用者應(yīng)該首先了解本儀器的結(jié)構(gòu)和工作原理,以及各個操縱旋鈕之功能。在未按通電源之前,應(yīng)該對儀器的安全性能進行檢查。
2. 指針式儀器尚未接通電源時,電表指針必須位于零刻度上,若不是這種情況,則可以用電表上的校正螺絲進行調(diào)零。
3. 儀器在制造廠原包裝條件下,應(yīng)儲存在環(huán)境溫度為5℃~35℃,濕度不超過85%的室內(nèi),且在空氣中不應(yīng)有足以引起腐蝕的有害物質(zhì)。
4. 儀器工作環(huán)境應(yīng)在在干燥的房間內(nèi),使用時放置在堅固平穩(wěn)的工作臺上,室內(nèi)照明不宜太強。
5. 比色皿使用完畢后,請立即用蒸餾水沖洗干凈,并用干凈柔軟的紗布將水跡擦去,以防止表面光潔度被破壞,影響比色皿的透光率。
6. 比色杯的配套性問題。比色杯必須配套使用,否則將使測試結(jié)果失去意義。
7. 鑒于儀器在出廠之前已經(jīng)調(diào)試到最佳狀態(tài),所以用戶不能擅自調(diào)整,更不能擅自打開機殼拆卸其中的零件(更換光源燈除外),尤其是拆卸單色器、不能碰傷或擦拭光學(xué)原件鏡面。
8. 如有故障急需自修,應(yīng)在廠方技術(shù)人員同意指導(dǎo)下,請具有相應(yīng)資質(zhì)的專業(yè)人員進行檢查、調(diào)整和維修,建議返修。

美譜達在光度計的方法學(xué)應(yīng)用、產(chǎn)品機械結(jié)構(gòu)、光學(xué)設(shè)計、電氣應(yīng)用和軟件開發(fā)等方面不斷開拓創(chuàng)新,相繼推出UV/Vis-1系列紫外/可見分光光度計,UV-3系列掃描型紫外/可見分光光度計,UV-6系列雙光束掃描型紫外/可見分光光度計,以滿足各類實驗室對分光光度計產(chǎn)品的不同需求,受到國內(nèi)外用戶的普遍好評。