蛋白質(zhì)的分離純化有多類(lèi)方法，如沉淀法（特別常用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法）、膜分離法（超濾法、透析法）、色譜法、離心分離法等。每類(lèi)方法有其自己的特點(diǎn)和適用范圍。如粗提常用沉淀法，精提就不會(huì)用沉淀法。這些方法中，應(yīng)用最廣的是色譜法。

　　色譜法，在生化和醫(yī)藥行業(yè)叫層析。但中國(guó)化學(xué)會(huì)、中科院相關(guān)部門(mén)及有關(guān)期刊都規(guī)定要叫色譜。在國(guó)家有關(guān)色譜名詞術(shù)語(yǔ)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中“chromatography”一詞翻譯成“色譜”。故在此我們將柱分離叫色譜。柱內(nèi)的分離介質(zhì)一般也叫填料、固定相。

　　在蛋白質(zhì)色譜純化中最重要的是分離介質(zhì)和色譜條件的選擇。有些從事分離工作的人，拿到樣品后常不知道怎么辦。其實(shí)這兩者的選擇只要根據(jù)分離對(duì)象和每種色譜的分離機(jī)理來(lái)考慮，就可以自行設(shè)計(jì)分離方案。蛋白質(zhì)分離介質(zhì)的選擇應(yīng)從蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)入手考慮。與一般小分子的天然產(chǎn)物和合成化合物的分離純化工作比起來(lái)，蛋白質(zhì)的分離有許多特殊性。

　　1.蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)決定了其分離工作的方法選擇。

　　蛋白質(zhì)分子量大，都在6KD以上，是由多個(gè)氨基酸按一定序列通過(guò)肽鍵組合成肽鏈，再由一個(gè)或多個(gè)肽鏈通過(guò)共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵組合成有復(fù)雜三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)還可能與糖、脂及核酸結(jié)合得到結(jié)合蛋白，不同的結(jié)合蛋白在性質(zhì)上會(huì)有差異。蛋白質(zhì)的外形為球狀和纖維狀，其大小因其分子量不同差異很大。故可以用排阻色譜、超濾和膜法分離大小不同的蛋白質(zhì)。

　　蛋白質(zhì)與氨基酸一樣，會(huì)兩性離解，在不同的pH下形成正離子或負(fù)離子，蛋白質(zhì)也有等電點(diǎn)。在相同的pH下，不同的蛋白質(zhì)表面帶電情況不一樣，故可以用離子交換色譜分離蛋白質(zhì)。

　　蛋白質(zhì)的氨基酸殘基會(huì)有一些苯基、烷基等疏水性基團(tuán)，這些疏水側(cè)鏈在水相中會(huì)盡可能避開(kāi)水相而藏于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，形成蛋白質(zhì)分子外部親水性基團(tuán)多，疏水性基團(tuán)多在蛋白質(zhì)裂隙內(nèi)部的情況，在不同條件下蛋白質(zhì)裂隙會(huì)有不同的伸展而暴露出內(nèi)部的疏水基團(tuán)。在同一個(gè)介質(zhì)中，不同蛋白質(zhì)表面的疏水性不同，可以用疏水相互作用色譜和反相色譜分離。

　　生物大分子有一個(gè)特性，某些分子或基團(tuán)對(duì)它們有特異性很強(qiáng)的吸附作用。這種作用只針對(duì)一種或一類(lèi)目標(biāo)物質(zhì)。如抗體特異性吸附抗原，苯甲脒對(duì)含絲氨酸的蛋白質(zhì)有吸附作用。這就是親和色譜的應(yīng)用原理, 一般的小分子是不會(huì)有這種特異性吸附作用的。

　　2.要特別注意保持樣品的生物活性。

　　蛋白質(zhì)有復(fù)雜的三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu)，熱、光和化學(xué)品會(huì)導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生理活性喪失，這叫失活。失活有可逆和不可逆兩種。不可逆失活的蛋白質(zhì)常是固體，不溶于水和溶劑，不再具有蛋白質(zhì)原有的生理性質(zhì)�？赡媸Щ畹牡鞍踪|(zhì)可用不同的復(fù)性方法恢復(fù)其原有的生理活性。

　　蛋白質(zhì)在選擇和評(píng)價(jià)分離純化的方法、介質(zhì)和色譜條件時(shí)，不僅要注意樣品的質(zhì)量回收率，還特別要重視活性回收率。要保持樣品的生物活性，在分離方法、填料、色譜條件和操作工藝上要注意。

　　在排阻、離子交換、疏水和反相、親和四類(lèi)色譜中，反相色譜一般容易使樣品失活，常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析，不太用于制備；其他的色譜方法，只要條件選擇合適，都可以得到高的活性回收率。

　　3.使用的色譜介質(zhì)要注意其合適的分子量適用范圍。

　　一般的介質(zhì)都是多孔的，多孔介質(zhì)的比表面有90%~95% 是在孔內(nèi)。分離時(shí)充分利用孔內(nèi)表面，柱容量才能大。所以要根據(jù)樣品分子量選擇具有合適的孔的介質(zhì)。在排阻色譜中孔的大小用排阻極限表示；其他色譜用分子量適用范圍表示，實(shí)際是其基質(zhì)的排阻極限。

　　常用的蛋白質(zhì)分離介質(zhì)是瓊脂糖和葡聚糖系列。瓊脂糖的分子量適用范圍取決于制備時(shí)瓊脂糖的濃度，大家熟悉的4B，糖的濃度是4%，適用6×10 4~2×10 7分子量；6B，糖的濃度是6%，適用1×10 4~4×10 6分子量。葡聚糖系列的分離范圍要看產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，從幾千到上千萬(wàn)不等。

　　常用的硅膠系列孔徑有用于小分子的6~12nm ；有用于一定分子量蛋白質(zhì)的30 、 50、100nm。

　　4. 生物大分子有不同于小分子的色譜特性。

　　包括蛋白質(zhì)在內(nèi)的生物大分子有一些特別的色譜性質(zhì)。

　　在梯度洗脫的色譜，如反相色譜、疏水色譜、離子交換中，強(qiáng)洗脫劑的濃度對(duì)保留值（容量因子）作圖有明顯的突躍。而有機(jī)小分子沒(méi)有此突躍。在蛋白質(zhì)分離的許多問(wèn)題可由此得到解釋。

　　5.紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)固定在280nm和220nm 。

　　280nm是檢測(cè)蛋白質(zhì)中的苯基，220nm是檢測(cè)肽鍵。蛋白質(zhì)檢測(cè)實(shí)際常在選用280nm 檢測(cè)波長(zhǎng)。

　　蛋白質(zhì)分離介質(zhì)選擇要同時(shí)考慮兩方面，一是配基，也就是選擇色譜模式；二是選擇基質(zhì)，包括基質(zhì)的種類(lèi)和排阻極限的選擇。

　　根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)品與雜質(zhì)的性質(zhì)差異選擇介質(zhì)是介質(zhì)選擇的主要依據(jù)。選擇了介質(zhì)也就是選擇了分離模式。

　　目標(biāo)產(chǎn)品與雜質(zhì)在分子大小、等電點(diǎn)pI、不失活或可逆失活條件下的疏水性、與親和配基的作用四種性質(zhì)上的差異是介質(zhì)選擇的主要依據(jù)之一。產(chǎn)品與雜質(zhì)某方面的性質(zhì)有大的差異，就可用來(lái)做為分離方法選擇的依據(jù)。目標(biāo)產(chǎn)品與雜質(zhì)分子大小差異大可用凝膠色譜分離；等電點(diǎn)pI差異大可用離子交換色譜分離；不失活或可逆失活條件下的疏水性差異大可用疏水色譜分離；與某個(gè)親和配基有特異作用的可用親和色譜分離。

　　在凝膠色譜、離子交換、疏水和反相、親和類(lèi)色譜中，反相色譜一般容易使樣品失活，常用于定性、定量分析和氨基酸序列分析，不太用于制備；其他的色譜方法，只要條件選擇合適，都可以得到高的活性回收率，可以用于制備分離。

　　基質(zhì)主要有3大類(lèi)：聚多糖，如交聯(lián)瓊脂糖、葡聚糖基質(zhì)；硅膠和多孔玻璃；有機(jī)聚合物（聚苯乙烯等）。

　　由于目標(biāo)產(chǎn)品限定在蛋白質(zhì)，分子量比較大，用于小分子的小孔填料肯定不能用。因?yàn)�，多孔填料的總的表面積，有90~95%是在孔內(nèi)，球型填料的球面上的面積只占有5~10%。小孔填料的柱容量太小。

　　大孔硅膠和多孔玻璃，與蛋白質(zhì)生物相容性差，大孔硅膠價(jià)格貴，表面活性基團(tuán)少，制備的填料會(huì)殘留酸性的硅羥基，造成非特異性吸附。大孔有機(jī)聚合物疏水性強(qiáng)，與蛋白質(zhì)生物相容性太差，不作親水性處理無(wú)法用于蛋白質(zhì)分離。

　　交聯(lián)瓊脂糖、葡聚糖基質(zhì)是最適合用于蛋白質(zhì)分離的基質(zhì)材料，這兩類(lèi)材料生物相容性好，無(wú)非特異性吸附，表面有大量羥基，可用于連接配基，制得各種填料。

　　瓊脂糖微球及其交聯(lián)后的產(chǎn)品一般叫4B、CL4B、4FF、6B、CL6B、6FF，這些產(chǎn)品再鍵合上不同基團(tuán)得到離子交換、疏水、親和色譜填料。4B、CL4B、4FF制備時(shí)的糖濃度為4%，排阻極限為6萬(wàn)~2000萬(wàn)。6B、CL6B、6FF制備時(shí)的糖濃度為6% ，排阻極限為1萬(wàn) ~400萬(wàn)。4B、6B耐壓低；CL4B、CL6B耐壓稍高一點(diǎn)，仍很低；4FF、6FF耐壓較高，使用壓力可到0.15或0.3MPa。

　　葡聚糖是線形結(jié)構(gòu)，用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)成球。因糖濃度和交聯(lián)度不同，得到不同排阻極限的微球。葡聚糖微球排阻極限范圍小些，在使用時(shí)不同條件下柱體積會(huì)有較大的變化，已逐漸較少用于離子交換、疏水、親和色譜，較多用于凝膠色譜。