分類和進(jìn)化研究是生物學(xué)中最古老的領(lǐng)域之一。過去的研究主要依靠生物體的形態(tài)，并輔以生理特征，來探討生物間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，有人稱之為經(jīng)典的方法，它是一百多年來完成微生物分類的主要方法。經(jīng)典的方法是隨機(jī)的和不系統(tǒng)的，只適用于一些形態(tài)復(fù)雜的真核生物和較大的原核生物�，F(xiàn)在，由于生物技術(shù)的不斷完善，人類對(duì)自然界的認(rèn)識(shí)水平不斷地提高，就對(duì)以前的一些研究方法以及研究結(jié)果提出了質(zhì)疑。如長久以來，生物界被劃分為原核、真核兩大界，認(rèn)為真核生物由原始的原核生物進(jìn)化而來。但隨著對(duì)原核生物各類群的研究的深入，卻發(fā)現(xiàn)許多生活在極端環(huán)境(高鹽、高溫、極端pH值)的古細(xì)菌(Archaebacteria)在生理生化諸多方面與一般的真細(xì)菌存在巨大差異，其分子機(jī)制亦相當(dāng)獨(dú)特。那么，這類古細(xì)菌是否應(yīng)當(dāng)從原核生物中獨(dú)立出來而自成一個(gè)體系呢？近年來，由于分子生物學(xué)的迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，特別是蛋白質(zhì)和核酸序列研究的突破性進(jìn)展，使微生物系統(tǒng)分類的基礎(chǔ)發(fā)生了重大的變化，分類系統(tǒng)已經(jīng)或正在隨著分子標(biāo)準(zhǔn)的不斷滲入而完善。所謂分子標(biāo)準(zhǔn)主要是指建立在DNA分析技術(shù)基礎(chǔ)上的分類方法。與表型特征相比較，核酸序列在生物體的進(jìn)化過程中較少受到環(huán)境的影響，因而更能反映出生物體在演變進(jìn)化過程中的本質(zhì)，其研究結(jié)論也更可靠。這樣，人們就將系統(tǒng)進(jìn)化研究從宏觀逐漸轉(zhuǎn)向微觀，并把宏觀和微觀的特征結(jié)合起來，以便更準(zhǔn)確地反映生物體間真正的進(jìn)化關(guān)系。

　　早期的分子標(biāo)準(zhǔn)主要建立在諸如DNA堿基比例測定或核酸分子雜交等基礎(chǔ)上。我們知道，每一種生物體均有其特有的、穩(wěn)定的核酸成分和結(jié)構(gòu)；不同生物間核酸成分和結(jié)構(gòu)的差異程度代表著它們之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。由此，從核酸分子水平來研究生物的進(jìn)化關(guān)系就成為分類學(xué)的一個(gè)新途徑，微生物分類學(xué)也不例外。最早在1956年由Lee等提出了DNA堿基比例的測定方法。DNA堿基比例主要是指“G+Cmol％"比例，即鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)在整個(gè)DNA中的摩爾百分比。不同種的微生物，其4種堿基的含量及排列順序不同，因此G+Cmol％比例一般會(huì)隨種的不同而有變化。一般來說，G+Cmol％差異愈大，分類地位愈疏遠(yuǎn)。而G+Cmol％比例相似，可能屬于同種，也可能不是同種，因?yàn)閴A基成分相似的DNA可能有很多種堿基順序。例如，螺菌屬(Spirillum)的G+Cmol％比例是38％～65％，輻度過寬。后來根據(jù)其堿基成分和其他特征的不同已被劃分成3屬：螺菌屬(Spirillum，38％)、海洋螺菌屬(Oceanspirillum，42％～48％)和水生螺菌屬(Aquaspirillum，50％～56％)。

　　如前所述，測定DNA的G+Cmol％比例只能確定含量不同的細(xì)菌為不同的種，而不能確定含量相近的細(xì)菌必然屬于同一個(gè)種。若要進(jìn)一步確定，還必須借助其他方法，例如核酸分子雜交方法。研究DNA-DNA或DNA-RNA雜交最方便的方法，就是采用來自一個(gè)菌株的放射性核酸與來自另一個(gè)菌珠的非放射性核酸，經(jīng)熱變性之后，把兩種核酸樣品混合，使其復(fù)性，測定放射性結(jié)合鍵的百分率。百分率越高，說明兩者堿基順序的同源性越高，亦即親緣關(guān)系越近。核酸分子雜交技術(shù)對(duì)解決種水平上的分類學(xué)問題和確定新種是十分有效的。

　　從20世紀(jì)70年代初起，16S rRNA序列分析成為細(xì)菌分類的一個(gè)重要指標(biāo)。16SrRNA分子具高度的保守性，在30多億年的進(jìn)化中仍保持著原初的狀態(tài)，因此可用作探索自古至今生物的主要進(jìn)化歷程，是一種理想的研究材料。1977年，Woese等人測定了200多種原核生物的16SrRNA和真核生物的18SrRNA的寡核苷酸順序譜，經(jīng)比較研究，不但搞清了原核生物和真核生物的許多系統(tǒng)進(jìn)化問題，而且還以此為根據(jù)提出了生命體系的三界學(xué)說，引起了生物學(xué)家的普遍關(guān)注，并由此而引發(fā)了研究古細(xì)菌的熱潮。16SrRNA寡核苷酸順序分析所依據(jù)的基本原理是這樣的，用可專一性地水解G(鳥嘌呤)上3′端磷酸酯鍵的核糖核酸酶水解提純的rRNA，產(chǎn)生一系列以G為結(jié)尾的長度不一的寡核苷酸片段，一一測定其核苷酸序列，最后把它們編成一部“詞典"。兩個(gè)菌株rRNA的相似性就可通過查閱“詞典"來作比較。但這種方法在當(dāng)時(shí)是一項(xiàng)工作量大，實(shí)驗(yàn)條件復(fù)雜和操作要求十分嚴(yán)格的分析技術(shù)，因此其應(yīng)用仍然受一定的限制。

　　80年代中期，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的出現(xiàn)和完善，以及利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行堿基序列分析方法的出現(xiàn)，使迅速得到特定DNA片段的遺傳信息成為現(xiàn)實(shí)，這樣就使得人們可以用完整而不是部分的DNA序列來判斷生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。1996年8月，《SCIENCE》發(fā)表了美國TICR(The Institute for Genomic Research)研究所的最新學(xué)術(shù)成果---產(chǎn)甲烷球菌的全基因組序列。這是自Woese提出三界學(xué)說以來測定的第一個(gè)古核生物(Archaea)的全基因組序列，從而為古核生物的研究提供了充分的序列材料。TIGR給出了產(chǎn)甲烷球菌的1738個(gè)基因的定位，經(jīng)同源性搜索和GENEMARK的基因定位方法研究，結(jié)果表明，約有58％的基因在現(xiàn)有生物的基因數(shù)據(jù)庫中找不到同源序列。這足以說明產(chǎn)甲烷球菌上有著大量的新基因序列，從而為三界學(xué)說的建立和發(fā)展找到了堅(jiān)實(shí)的證據(jù)。

　　在國內(nèi)，利用PCR技術(shù)研究系統(tǒng)進(jìn)化問題尚處起步階段。周培瑾、徐毅等人自1994年起首先開展了這方面的工作。他們用PCR技術(shù)擴(kuò)增了嗜鹽菌的16SrRNA；并在此基礎(chǔ)上將一株從新疆鹽湖分離到的嗜鹽菌B2菌株進(jìn)行了16SrRNA核苷酸序列分析；最后通過比較它與嗜鹽菌各屬中其他種的16SrRNA序列的相互關(guān)系，鑒定B2菌株為嗜鹽小盒菌屬的一個(gè)新種。他們的工作在國內(nèi)，特別是嗜鹽菌的系統(tǒng)發(fā)育研究方面尚屬首次。

　　利用PCR方法研究系統(tǒng)進(jìn)化一般要進(jìn)行以下程序：
　　(1)樣品來源及模板制備 用以抽提模板DNA的樣品只需極少量，且模板用量也極低，只需幾個(gè)納克(新鮮樣品)，抽提過程較為簡單，可用經(jīng)典的DNA或RNA提取法。
　　(2)對(duì)稱PCR 根據(jù)選用的引物來擴(kuò)增模板DNA的特異性雙鏈片段。這個(gè)過程引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要。若設(shè)計(jì)不合理，擴(kuò)增出非特異性片段，則會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的推斷。一般來說，引物應(yīng)位于待分析基因組中的高度保守區(qū)域，長度以15～30hp為宜。
　　(3)不對(duì)稱PCR 利用對(duì)稱PCR的雙鏈產(chǎn)物作為其擴(kuò)增的模板DNA，控制兩種引物的用量之比為1∶50或1∶100，就可根據(jù)單引物來擴(kuò)增出特異性的單鏈DNA。
　　(4)堿基序列測定 利用單鏈DNA產(chǎn)物進(jìn)行堿基序列分析。這項(xiàng)工作因自動(dòng)測序儀的出現(xiàn)而變得簡單易行。
　　(5)DNA序列數(shù)據(jù)分析 通過PCR得到特異性DNA片段的堿基序列只是進(jìn)化研究工作中的一個(gè)中間環(huán)節(jié)，最終還必須對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析推斷，對(duì)序列數(shù)據(jù)分析的方法很多。

　　目前，PCR技術(shù)在系統(tǒng)進(jìn)化研究中得到廣泛應(yīng)用，PCR途徑對(duì)模板DNA的純度要求不高，所需樣品量也極低，這就為抽提過程簡單化創(chuàng)造了條件。可直接得到核苷酸的真實(shí)序列。這樣，通過序列之間的直接比較，就更能說明問題，所得結(jié)果也更可靠。另外，在原有PCR技術(shù)基礎(chǔ)上結(jié)合各種生化分子生物學(xué)技術(shù)，還衍生了許多改良技術(shù)，大大方便了這方面的研究工作。如PCR-SSCP是最近發(fā)展起來的一種非同位素、快速、簡便、靈敏度高的檢測基因突變的新技術(shù)，目前被廣泛應(yīng)用于篩選DNA點(diǎn)突變。再如PCR-RAPD可通過任意選擇一個(gè)或二個(gè)引物，對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物可經(jīng)1.5％～2％瓊脂糖電泳或在擴(kuò)增的同時(shí)摻入32P，然后經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影得到DNA指紋圖譜。其他還有諸如PCR定量檢測技術(shù)、PCR-RELP等等。另外，繼PCR擴(kuò)增技術(shù)之后，又有一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)---NASBA技術(shù)問世了。它與PCR不同的是：PCR技術(shù)要求有3個(gè)不同的溫度，而NASBA只需在一種溫度下就可以完成反應(yīng)；NASBA的核酸擴(kuò)增效率甚至比PCR的擴(kuò)增效率還要高，2小時(shí)內(nèi)目的基因可以擴(kuò)增109倍；更主要的是NASBA能直接擴(kuò)增單鏈RNA上的特異序列，這對(duì)RNA的研究意義非常重大。相信這項(xiàng)新技術(shù)的出現(xiàn)和廣泛應(yīng)用將大大加快各領(lǐng)域中的各項(xiàng)研究。

　　總之，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，給系統(tǒng)進(jìn)化研究帶來了越來越多的便利和可靠性，隨之也推動(dòng)了微生物系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的建立和發(fā)展。據(jù)報(bào)道，在不遠(yuǎn)的將來，以表型為主的分類體系將發(fā)生大的變化，從而能更精確地反映微生物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。