在免疫組化過(guò)程中，為了更好的說(shuō)明問(wèn)題和查找原因，最好設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照片(已知的高表達(dá)相應(yīng)抗原的組織)和陰性對(duì)照組織片(不加一抗但是加二抗系統(tǒng)/不加任何抗體兩組)，所有操作過(guò)程應(yīng)完全一致。

　　染色弱或者沒(méi)有染色(按照先后順序，先排除一些簡(jiǎn)單的原因)：

　　試劑使用順序錯(cuò)誤或者漏加試劑重復(fù)實(shí)驗(yàn)，保證每一步均正確

　　二抗和一抗不匹配選擇匹配的二抗

　　底物和酶不匹配選用匹配的底物

　　酶失活換用新的酶(將酶和底物混合，看是否顯色?)

　　組織中沒(méi)有待測(cè)抗原表達(dá)或者表達(dá)水平低使用陽(yáng)性對(duì)照片

　　抗體濃度太低增加抗體濃度.最好使用不同濃度的抗體，決定最佳濃度

　　抗體孵育時(shí)間不充分延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間

　　底物孵育不充分延長(zhǎng)底物孵育時(shí)間

　　抗體儲(chǔ)存不當(dāng)，導(dǎo)致失效將抗體分裝，低溫保存 (-20 to -70 C) ，避免反復(fù)凍溶。稀釋抗體在4保存1-2周，避免時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。或者根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行恰當(dāng)?shù)谋４?

　　一抗失效換用新的一抗

　　二抗失效換用新的抗體(能否成功與其它一抗配合?)

　　脫石臘不充分延長(zhǎng)脫臘時(shí)間或者換用新的二甲苯

　　組織固定不充分或者不當(dāng)增加固定時(shí)間或者改用不同的固定方法

　　組織固定過(guò)度減少固定時(shí)間。若已固定過(guò)度，則需使用正確的或者推薦的抗原修復(fù)方法

　　復(fù)染試劑與底物系統(tǒng)不匹配選擇正確的復(fù)染試劑(不加復(fù)染劑，看是否有組織染色?)

　　封片劑不正確選擇正確的封片劑

　　染色背景高：

　　可能原因解決辦法

　　洗片不充分每步之間至少洗片3次

　　組織含有內(nèi)源性的酶，如HRP/AP在加入一抗之前使用3%的H2O2甲醇封閉內(nèi)源性HRP活性，使用左旋咪唑(levamisole)溶液阻斷內(nèi)源性AP活性�；蛘邠Q用葡萄糖氧化酶系統(tǒng)

　　組織含有內(nèi)源性生物素(尤其是腎臟、肝和脾)在加入一抗之前，血清封閉之后使用avidin/biotin阻斷試劑�；蛘弑苊馐褂胋iotin-avidin系統(tǒng)或改用IF方法(直接將酶和底物加到組織片上，看是否顯色?)

　　一抗的非特異性結(jié)合或者抗體濃度過(guò)高增加一抗的稀釋度

　　二抗和組織非特異性結(jié)合使用與二抗來(lái)源相同的正常動(dòng)物血清(一般是10%)封閉，必要時(shí)可以將血清濃度加大

　　組織固定不充分，抗原擴(kuò)散Increase duration of postfixation

　　使用小鼠來(lái)源的二抗檢測(cè)小鼠組織在加一抗之前使用MouseOnMouse封閉試劑

　　干片染色過(guò)程中避免出現(xiàn)干片現(xiàn)象

　　染色強(qiáng)度過(guò)大：

　　可能原因 解決辦法

　　一抗或者二抗?jié)舛冗^(guò)高降低抗體濃度。或者使用不同的濃度，決定最佳染色濃度

　　孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)減少孵育時(shí)間

　　孵育溫度太高降低孵育溫度，在4℃過(guò)夜或者37℃0.5-1小時(shí)或者RT

　　底物孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)減少孵育時(shí)間

　　干片染色過(guò)程中避免出現(xiàn)干片現(xiàn)象