目的要求

　　1.掌握一般培養(yǎng)基制備的原則和要求。

　　2.熟悉一般培養(yǎng)基制備的過程。

　　操作步驟

　　一、培養(yǎng)基的制備原則和要求

　　培養(yǎng)基是根據(jù)各類微生物生長(zhǎng)繁殖的需要，用人工方法把多種物質(zhì)混合而成的營養(yǎng)物。一般用來分離、培養(yǎng)菌類。常用的培養(yǎng)基有基礎(chǔ)培養(yǎng)基、增菌培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基和厭氧培養(yǎng)基。在制備培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)掌握如下原則和要求：

　　(一)培養(yǎng)基必須含有細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需要的營養(yǎng)物質(zhì)。所用的化學(xué)藥品必須純凈，稱取的份量務(wù)必準(zhǔn)確。

　　(二)培養(yǎng)基的酸堿度應(yīng)符合細(xì)菌生長(zhǎng)要求。按各種培養(yǎng)基要求準(zhǔn)確測(cè)定調(diào)節(jié)pH值。多數(shù)細(xì)菌生長(zhǎng)的適宜pH值為7.2～7.6，呈弱堿性。

　　(三)培養(yǎng)基的滅菌時(shí)間和溫度，應(yīng)按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進(jìn)行，以保證滅菌效果及不損失培養(yǎng)基的必需營養(yǎng)成分。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，必須置37℃溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)，無菌生長(zhǎng)者方可應(yīng)用。

　　(四)所用器皿須潔凈，忌用鐵或鋼質(zhì)器皿，要求沒有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)存在。

　　(五)制成的培養(yǎng)基應(yīng)該是透明的，以便觀察細(xì)菌生長(zhǎng)性狀以及其他代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的變化。

　　二、培養(yǎng)基制備過程

　　不同的培養(yǎng)基其制備方法也不同，一般包括以下步驟：

　　(一)準(zhǔn)確稱量試劑 根據(jù)不同的菌類和用途，選擇適宜的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基所需試劑必須純凈。

　　(二)校正pH值 將稱量好的培養(yǎng)基各種成分放入容器內(nèi)，標(biāo)記劃線，加熱溶解，補(bǔ)充水分，測(cè)定酸堿度，常用pH6.8～8.0的精密試紙或酸度計(jì)測(cè)定。用1N

　　NaOH和1N HCl調(diào)節(jié)pH值到適宜范圍內(nèi)。

　　(三)過濾 將玻璃漏斗置鐵架上，再用紗布夾棉花或用濾紙放在漏斗中，將上述培養(yǎng)基倒入其中過濾至透明。

　　(四)分裝 將過濾后的培養(yǎng)基分裝于中試管或三角瓶?jī)?nèi)(試管內(nèi)每支裝5mL;三角瓶中裝100～150ml)，塞好棉塞用牛皮紙包扎好，準(zhǔn)備滅菌。

　　(五)滅菌

　　培養(yǎng)基的滅菌，常用高壓蒸汽滅菌法。一般微生物的營養(yǎng)細(xì)胞在水中煮沸后即被殺死，但細(xì)菌的芽胞有較強(qiáng)的抗熱性，須經(jīng)高壓蒸汽滅菌才能達(dá)到徹底滅菌的目的。根據(jù)蒸汽溫度隨壓力升高而上升的原理，即壓力越大，蒸汽溫度就越高。因此，在同一溫度條件下，采用高壓蒸汽滅菌比干熱滅菌法效果要好。而且在濕熱情況下，菌體吸收水分后，其蛋白質(zhì)易于凝固變性，因?yàn)檎羝�的穿透力�?qiáng)，殺菌效果好。

　　高壓蒸汽滅菌，一般采用15磅/平方(即1.05kg/cm2)壓力，此時(shí)的溫度是121.3℃。滅菌20～30分鐘后，可達(dá)到完全滅菌的目的。在進(jìn)行滅菌的時(shí)候，首先要把滅菌鍋內(nèi)的冷空氣排出，否則，冷空氣存在會(huì)降低鍋內(nèi)的實(shí)際溫度，影響滅菌效果。

　　三、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備

　　(一)牛肉浸液(肉水)

　　1.成分 新鮮牛肉 500g ，水1000 ml。

　　2.制法

　　(1)取新鮮牛肉，剔除肌膜、脂肪，切成小塊，用絞肉機(jī)絞碎。

　　(2)按上述比例加水，浸泡過夜(夏天應(yīng)將浸泡液放置在低溫的地方，防止腐敗;如果沒有冷藏條件時(shí)，可省去浸泡過夜這一步)，其間應(yīng)攪拌數(shù)次。

　　(3)次日取上液煮沸一小時(shí)，并不斷攪拌。

　　(4)補(bǔ)足蒸發(fā)的水分，用白布或絨布過濾后分裝于三角瓶中，準(zhǔn)備滅菌。

　　(5)置高壓滅菌器內(nèi)，15磅滅菌20～30分鐘，置低溫、暗處保存?zhèn)溆谩?

　　3.用途

　　用于制備各種培養(yǎng)基的基礎(chǔ)液。

　　(二)肉浸液肉湯(普通肉湯)

　　1.成分 肉水 1000 ml ，蛋白胨 10g，氯化鈉 5g，磷酸氫二鉀 2g。

　　2.制法

　　(1)將以上成份加溫溶于牛肉浸液中。

　　(2)調(diào)pH值為7.4～7.6。

　　(3)濾紙過濾后分裝。

　　(4)15磅20～30分鐘滅菌后備用。

　　3.用途 作一般細(xì)菌培養(yǎng)用。

　　(三)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(普通瓊脂)

　　1.成分 肉水 1000ml，蛋白胨10g，磷酸氫二鉀 lg ，氯化鈉 5g，瓊脂 20g。

　　2.制法

　　(1)將上述成分混合后，加熱溶解，補(bǔ)足水份。

　　(2)校正pH值7.4～7.6。

　　(3)用紗布夾棉花過濾。

　　(4)分裝于中試管或三角瓶中。

　　(5)高壓滅菌20～30分鐘后，將中試管擺成斜面，保存?zhèn)溆谩?

　　3.用途 一般細(xì)菌分離培養(yǎng)、菌種保存或用作特殊培養(yǎng)基。

　　(四)半固體培養(yǎng)基 基本上與營養(yǎng)瓊脂的制備相同，僅將瓊脂量減少至0.5～0.7%(1000 ml中加5～7g瓊脂)即可。

　　(五)鮮血瓊脂

　　將滅菌的營養(yǎng)瓊脂加熱溶化，冷卻至45～50℃時(shí)，加入5～8%無菌脫纖鮮血(綿羊、黃牛、馬和兔等)，分裝于試管后立即擺成斜面、或傾注于平皿中，待凝固后，置37℃培養(yǎng)1～2日。有污染者廢棄;無菌者保存，置冰箱備用。

　　無菌脫纖維鮮血的制備：以無菌操作采取動(dòng)物鮮血(綿羊、黃牛、馬從頸靜脈采血;兔則從心臟采血)，放入帶玻璃珠的無菌三角瓶?jī)?nèi)，搖動(dòng)5～10分鐘，放冰箱中備用。