一.概述

　　化學(xué)發(fā)光 (ChemiLuminescence ，簡稱為 CL) 分析法是分子發(fā)光光譜分析法中的一類，它主要是依據(jù)化學(xué)檢測體系中待測物濃度與體系的化學(xué)發(fā)光強度在一定條件下呈線性定量關(guān)系的原理，利用儀器對體系化學(xué)發(fā)光強度的檢測，而確定待測物含量的一種痕量分析方法�；瘜W(xué)發(fā)光與其它發(fā)光分析的本質(zhì)區(qū)別是體系產(chǎn)生發(fā)光 ( 光輻射 ) 所吸收的能量來源不同。體系產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，必須具有一個產(chǎn)生可檢信號的光輻射反應(yīng)和一個可一次提供導(dǎo)致發(fā)光現(xiàn)象足夠能量的單獨反應(yīng)步驟的化學(xué)反應(yīng)。

　　化學(xué)發(fā)光Western 雜交檢測，是同位素檢測的一種高度靈敏的替代方法。酶標(biāo)記抗體取代了放射性標(biāo)記抗體，當(dāng)它作用于底物時，可產(chǎn)生光信號。多數(shù)特異抗原檢測方法以辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)二級抗體耦聯(lián)物為基礎(chǔ)。信號可通過感光膠片或?qū)Ｓ玫某上裨O(shè)備來采集�；瘜W(xué)發(fā)光底物用于免疫印跡技術(shù)已有十幾年的歷史，目前大部分實驗室做轉(zhuǎn)印時都會采用化學(xué)發(fā)光技術(shù)進行檢測。隨著冷CCD化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在越來越多的實驗室都開始采用冷CCD的凝膠成像系統(tǒng)進行化學(xué)發(fā)光的檢測，膠片成像雖然比自然發(fā)光法靈敏度更高，但也有很多缺點：耗時，需要暗房，顯影劑和膠片，膠片較貴且為需持續(xù)購買的消耗品。同時由于膠片的線性范圍較窄，因此用膠片上的條帶(特別是表達量較低的條帶)進行定量幾乎不可能。冷CCD技術(shù)與X膠片相比具有瞬時影像處理、高靈敏度和高分辨率、動力范圍廣等優(yōu)點，因此能對條帶進行精確定量。當(dāng)然這項技術(shù)要求底物能產(chǎn)生高強度長持續(xù)時間的信號，以保證信號能被冷CCD的凝膠成像系統(tǒng)捕獲。在這方面多家公司都提供了相應(yīng)的化學(xué)發(fā)光底物或試劑盒，特別是Bio-Rad公司提供的Western-C化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，底物可產(chǎn)生高強度的持續(xù)光信號24小時，因此用戶可以進行多次曝光，最低可檢測至10-19mol，配合Bio-Rad屢獲大獎的化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiDoc XRS或VersaDoc系統(tǒng)能得到得到高質(zhì)量的印記信號。

　　我們實驗室從05年開始采用Bio-Rad的ChemiDocXRS進行化學(xué)發(fā)光的檢測，目前已經(jīng)形成一套較為成熟的技術(shù)路線，取得大批的實驗數(shù)據(jù)。本文將就Western Blotting的關(guān)鍵步驟及使用ChemiDocXRS的一些心得體會與大家一起分享。

　　二.轉(zhuǎn)印過程

　　轉(zhuǎn)印蛋白的方法有多種，最常用的是電泳轉(zhuǎn)印方法，該技術(shù)具有快速、有效、并保持蛋白在凝膠中高分辨率的特性。電泳轉(zhuǎn)印技術(shù)是指在凝膠中分離的蛋白質(zhì)向印跡膜載體轉(zhuǎn)印的過程。由于該技術(shù)可以準(zhǔn)確、快速、高效的將蛋白轉(zhuǎn)印到膜上，并可以保持蛋白在凝膠中高的分辨率，而被廣泛的應(yīng)用于轉(zhuǎn)移印跡技術(shù)中。

　　常用的電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)有槽轉(zhuǎn)印系統(tǒng)和半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，前者是將凝膠和印跡膜浸入轉(zhuǎn)印緩沖液槽，然后加電壓進行轉(zhuǎn)印;后者是將凝膠和印跡膜放置于濾紙間形成三明治結(jié)構(gòu)，而后在電極平板間進行轉(zhuǎn)印。

　　電泳轉(zhuǎn)印過程中，凝膠和印跡膜平行放置于兩極間，見圖。根據(jù)歐姆定律(Ohm’s)：

　　V=I*R，R為兩極間物質(zhì)的電阻值，(即轉(zhuǎn)印緩沖液、凝膠、印跡膜、濾紙的電阻值)，當(dāng)電極兩端加有電壓時，就會在上述物質(zhì)間產(chǎn)生電流，蛋白樣品便發(fā)生轉(zhuǎn)印。

　　由于兩極間的電場強度(V/cm)是蛋白轉(zhuǎn)移的驅(qū)動力，因此兩極間的電壓和距離稱為凝膠上蛋白轉(zhuǎn)印的關(guān)鍵參數(shù)。同樣其他參數(shù)包括蛋白的大小、形狀、所帶電荷多少，電轉(zhuǎn)印緩沖液的pH值、黏度、離子強度、以及凝膠密度也影響著蛋白的電轉(zhuǎn)印效率。

　　在轉(zhuǎn)印過程中將產(chǎn)生大量熱量，因此對電場強度要有一定的限制。轉(zhuǎn)印中產(chǎn)生的焦耳熱(Joule)與電源參數(shù)P成正比，P=I*V=I2R。電泳轉(zhuǎn)印緩沖液的溫度隨著焦耳熱的增加而升高，此時其電阻卻明顯下降。電阻的降低將會使轉(zhuǎn)印過程和電場強度發(fā)生變化，從而影響電轉(zhuǎn)印緩沖液的緩沖能力。同時，系統(tǒng)過熱還會引起凝膠的損壞或與印跡膜發(fā)生粘連。從而槽體的散熱能力將直接影響電泳轉(zhuǎn)印效率。

　　本室主要以濕轉(zhuǎn)進行轉(zhuǎn)印，因此本文就濕轉(zhuǎn)為例，對化學(xué)發(fā)光和ChemiDoc XRS的應(yīng)用進行敘述。

　　一、轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn))：

　　(1)轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備2張6.5*10cm的濾紙和1張5.5*8.5cm的PVDF膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的PVDF膜浸于甲醇中不少于15分鐘才可使用。

　　(2)在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、兩張濾紙和浸過的PVDF膜。

　　(3)打開夾子將黑的一面放入轉(zhuǎn)膜液中，從下往上依次放入海綿、濾紙、分離膠、PVDF膜、濾紙、海綿。

　　注意:1整個過程在轉(zhuǎn)膜液中進行在鋪每一層時要用刮子趕氣泡，尤其是膠與膜之間一定不能留有氣泡。

　　2撬玻璃板剝膠時動作要輕，用刮子將濃縮膠輕輕刮去小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊

　　(4)將夾子合好，放到轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。接通電電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊有較大空隙，放入事先準(zhǔn)備好的冰盒來降溫。將整個電泳槽放入一個大的容器中(大的塑料泡沫盒子最好)，在這個容器中盛滿冰。

　　(5) 250毫安恒流轉(zhuǎn)膜2小時。

　　(6)2小時后，將膜取出，用TBST洗膜5分鐘。

　　(7)用5%脫脂奶粉室溫封閉。

　　封閉是為了使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。

　　脫脂奶粉要用TBST配置，要在干凈的容器里進行封閉，且足以覆蓋住膜。

　　二、孵育一抗

　　一抗用BSA溶解，根據(jù)抗體說明書上的要求稀釋抗體(大部分稀釋度為1：1000)，4℃過夜。 也可根據(jù)抗體量和膜上抗原量適當(dāng)延長或縮短時間。

　　(有些一抗室溫孵育一小時也可得到滿意的結(jié)果)

　　三、孵育二抗

　　室溫孵育1小時。 一般采用HRP標(biāo)記的二抗，稀釋比例為1:2000。

　　二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導(dǎo)致非特異性的結(jié)合。

　　注意：孵育二抗之前一定要用 TBST將膜洗三次，每次五分鐘，時間一定要夠。

　　洗滌是為了洗去二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。

　　四、曝光

　　本實驗室選用威格拉斯 “western 發(fā)光檢測試劑盒”，如采用Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學(xué)發(fā)光試劑盒(已針對CCD成像做了優(yōu)化)，可獲得更好的效果。

　　(1)洗膜，2至3次，每次5分鐘

　　(2)在照膠儀放膜的平板上加少許水，取一張與平板大小合適的保鮮膜鋪在平板上，排氣泡。

　　作用：

　　a 保證PVDF膜能在一個相對干凈的平臺上曝光，避免污染。

　　b 鋪上保鮮膜后，背景顏色是純黑色且深淺均勻，這樣當(dāng)半透明的PVDF膜在白測光下照Marker時，會更清晰、明顯。

　　(3)將膜放入照膠儀，調(diào)整明暗、大小、焦距，在目的條帶的marker出，用圓珠筆標(biāo)一個印記。

　　(4)選擇EPI WHITE 光，點擊“White Epi IIIumination”點擊 Auto Expose 獲取marker圖片，圖片最大化，選中圖片，選擇file ->export to jpeg，quantity調(diào)至最大值100，保存至文件夾。保存為jpeg格式后，轉(zhuǎn)至其他電腦即使未安裝quantity one 軟件也可用其他圖像軟件編輯圖片。

　　(5)將發(fā)光液A液和B液按1：1比例混勻、倒在PVDF膜上，發(fā)光液能蓋住膜即可，關(guān)閉WHITE EPI光(注意膜的位置從照Marker開始，不要改變)點擊“Chem Hi Sensitivity”，點擊“Live Acquire”選擇合適的曝光時間，張數(shù)，選擇指定文件夾，保存。

　　選擇比較滿意的圖片，按如上所說轉(zhuǎn)換至jpeg格式。

　　例如，Caveolin-3、AKT、ERK、GSK等比較好曝的，可以調(diào)至10s一張，一般10張之內(nèi)就可得到好的效果。其他不太容易出條帶的，可以適當(dāng)延長時間。

　　對于內(nèi)參來說，在曝第一張之前，讓發(fā)光液倒在膜上靜置反映20-30秒，有時會得到理想的效果。

　　(6)marker與目的條帶的比對：用 window自帶的“圖片和傳真查看器”軟件打開jpeg格式的marker圖片，用手在屏幕上點住剛剛用圓珠筆畫的印記，手不要松開，此時還用“圖片和傳真查看器”打開jpeg格式的目的條帶的圖片，手點的地方就是剛才marker的位置。

　　結(jié)論：采用Bio-Rad的冷CCD化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進行化學(xué)發(fā)光的檢測，比傳統(tǒng)的暗室曝光方法更為簡便，也大大縮短了實驗時間。但在成像時需要注意選擇合適的化學(xué)發(fā)光試劑，以適合CCD的成像檢測。且大部分的化學(xué)發(fā)光試劑均對應(yīng)暗室曝光的方式，因此在進行檢測需要進行調(diào)整，如對發(fā)光液不能進行稀釋，而必須要使用原液。同時如果條帶的表達比較弱的情況下，如使用常用發(fā)光液可能需要更長的成像時間，當(dāng)然更好的方法是選擇能快速產(chǎn)生強烈信號的化學(xué)發(fā)光試劑，如Bio-Rad公司的Immun-Star WesternC化學(xué)發(fā)光試劑盒。