一、分光光度計(jì)的工作原理
  分光光度法是根據(jù)被測(cè)物質(zhì)分子對(duì)紫外、可見(jiàn)波段范圍單色輻射的吸收或反射強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行物質(zhì)的定性、定量或結(jié)構(gòu)分析的一種方法。
  物質(zhì)呈現(xiàn)特征的顏色，這是由于它們對(duì)可見(jiàn)光中某些特定波長(zhǎng)的光線選擇性吸收的緣故。實(shí)際上，一切物質(zhì)都會(huì)對(duì)可見(jiàn)光和不可見(jiàn)光中的某些波長(zhǎng)的光線進(jìn)行吸收。但是，一切光線并不都是以相同的程度被物質(zhì)吸收的。物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光線表現(xiàn)不同的吸收能力，叫做選擇性吸收。各種物質(zhì)對(duì)光線的選擇性吸收這一性質(zhì)，反映了它們分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異，即各種物質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)決定了它們對(duì)不同光線的選擇吸收。
  朗伯-比耳定律 （Lambert-Beer）是幾乎所有的光學(xué)分析儀器的基本工作原理，它由朗伯定律和比耳定律合并而成。 
          朗伯定律表明：如果溶液的濃度一定，則光對(duì)物質(zhì)的吸收程度與它通過(guò)的溶液厚度成正比。 
          比耳定律表明：如果吸光物質(zhì)溶于不吸光的溶劑，則吸光度和吸光物質(zhì)的濃度成正比。 
兩者合成后的數(shù)學(xué)表達(dá)式如下： 
      T=I/I。 （1） 
      A=KCL=‐㏒ I/Io （2） 
其中 
    T 透過(guò)率 
    A 吸光度 
    C 溶液濃度 
    K 溶液的吸光系數(shù) 
    L 液層在光路中的長(zhǎng)度  
    I 光透過(guò)被測(cè)試樣后照射到光電轉(zhuǎn)換器上的強(qiáng)度 
    Io 光透過(guò)參比測(cè)試樣后照射到光電轉(zhuǎn)換器上的強(qiáng)度 

二、產(chǎn)品類型結(jié)構(gòu)：

光度計(jì)
      可見(jiàn)分光光度計(jì)  
           紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)    
                 掃描型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)
                        雙光束紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì) 

三、儀器技術(shù)參數(shù)解釋
     波長(zhǎng)范圍：儀器可選波長(zhǎng)的測(cè)量范圍。不同的物質(zhì)吸收所對(duì)應(yīng)的吸收波長(zhǎng)不一樣。 
    氘燈：紫外光源                    185-400nm 
    鎢燈：可見(jiàn)和近紅外光源      250---2000nm              
   光譜帶寬：目前國(guó)際上對(duì)光譜帶寬的測(cè)試方式一般用“譜線輪廓法”，主要是選用某些光源的特征譜線，對(duì)它進(jìn)行光譜掃描，繪出該譜線的輪廓，再測(cè)出該譜線的半峰高的寬度即為光譜帶寬（又稱自然光譜帶寬）。儀器使用的光譜帶寬通常要比自然光譜帶寬小10倍以上。
    波  長(zhǎng)  準(zhǔn)  確  度：也叫波長(zhǎng)精度，是波長(zhǎng)的實(shí)際測(cè)定值與理論值的差值。
   波  長(zhǎng)  重  復(fù)  性：多次測(cè)量（一般是3次）最大值與最小值之間的差值。
   光  度  準(zhǔn)  確  度：光度測(cè)量值與光度理論值之差。 
   影響光度準(zhǔn)確度的主要因素： 
      ①雜散光      ②光度噪聲      ③基線平直度 
      ④光譜帶寬  ⑤試樣來(lái)源      ⑥試樣制備 
      ⑦比色皿 
   光  度  重  復(fù)  性：多次測(cè)量（一般是3次）最大值與最小值之間的差值。  
   影響光度重復(fù)性的主要因素： 
      ①光源系統(tǒng)（氘燈、鎢燈）       
      ②光電轉(zhuǎn)換器系統(tǒng) 
      ③電源系統(tǒng)       
      ④環(huán)境 
  雜    散    光：不同于測(cè)試所需要的波長(zhǎng)的光叫做雜散光。 

影響雜散光的主要因素： 
  ①灰塵沾污光學(xué)元件   ②隔板邊緣的反射 
  ③光學(xué)系統(tǒng)屏蔽不好   ④狹縫的缺陷 
  ⑤光束孔徑不匹配       ⑥光學(xué)系統(tǒng)的像差 
  ⑦單色器內(nèi)壁黑化處理不當(dāng)   等等 

      雜散光對(duì)分析測(cè)試結(jié)果的誤差影響是隨著吸光度值增大而增大的，會(huì)使結(jié)果偏離比耳定律。 
       
      ·雜散光被試樣吸收時(shí)，偏離是正值。 
      ·雜散光不被試樣吸收時(shí)，偏離是負(fù)值。  

穩(wěn)    定    性：穩(wěn)定性包括基線漂移和光度重復(fù)性。 
       
基線漂移是指冷態(tài)開(kāi)機(jī)預(yù)熱2小時(shí)后調(diào)零，試劑和參比比色皿都為空氣，在固定波長(zhǎng)（500nm）下連續(xù)測(cè)定吸光度1小時(shí)，最大值和最小值之差。 
光度噪聲（噪聲）： 
      
       噪聲是指冷態(tài)開(kāi)機(jī)預(yù)熱0.5小時(shí)后調(diào)零，試劑和參比比色皿都為空氣，在500nm下連續(xù)測(cè)定吸光度1小時(shí)，偏離零點(diǎn)的最大值。 
      基線平直度： 
      基線平直度是指冷態(tài)開(kāi)機(jī)預(yù)熱0.5小時(shí)后調(diào)零，從長(zhǎng)波長(zhǎng)向短波長(zhǎng)對(duì)儀器進(jìn)行全波長(zhǎng)慢速掃描吸光度，偏離零點(diǎn)的最大值。 
吸光度和透過(guò)率的關(guān)系：透過(guò)率和吸光度是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，關(guān)系式如下： 
A=2 – lgT% 
其中    A為吸光度 
           T為透過(guò)率 
        若T=100%，A = 2 - lg100 = 2 - 2 = 0 
        若T=10%  ，A = 2 - lg10   = 2 - 1 = 1 
光度分析：固定波長(zhǎng)下測(cè)定樣品的吸光度和透過(guò)率。 

定量分析：通過(guò)對(duì)已知濃度的樣品進(jìn)行吸光度的測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出曲線的線性方程C=KA+b。再測(cè)定未知樣品的吸光度，通過(guò)線性方程求出樣品的濃度。 
動(dòng)力學(xué)測(cè)試：固定波長(zhǎng)下，測(cè)定樣品在一段時(shí)間內(nèi)吸光度或透過(guò)率的變化圖譜，可計(jì)算樣品的反應(yīng)率△A/t。 
       
    需設(shè)定的參數(shù)： 
         掃描時(shí)間，最多9小時(shí)； 
         采樣間隔，最小為0.5秒； 
         延時(shí)時(shí)間 
         掃描波長(zhǎng) 
全波長(zhǎng)掃描：在儀器波長(zhǎng)范圍內(nèi)，設(shè)定任意波長(zhǎng)區(qū)間，對(duì)未知試樣進(jìn)行吸光度、透過(guò)率的圖譜掃描。 
       
     需設(shè)定的參數(shù)： 
         掃描波長(zhǎng)范圍 
         掃描間隔，0.1、0.2、0.5、1、2、5nm； 
         掃描速度，建議為低速； 
         T/A模式 
圖譜處理 
     圖譜放大、縮小、峰谷檢測(cè)、平滑等處理； 
     圖譜存儲(chǔ)和調(diào)用； 
     使用PC版軟件可進(jìn)行1-4階求導(dǎo)、四則運(yùn)算、疊加等分析。
多波長(zhǎng)測(cè)試：對(duì)某一待測(cè)物質(zhì)在多個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)進(jìn)行吸光度、透過(guò)率測(cè)試。 
  
    單機(jī)版可測(cè)試10個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)； 
      PC版可測(cè)試32個(gè)波長(zhǎng)點(diǎn)。
DNA/蛋白質(zhì)測(cè)試 
    測(cè)試波長(zhǎng)缺省值為260、280、320nm，可修改。 
    可計(jì)算DNA、Protein的濃度和Ratio。 

單光束分光光度計(jì)特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜 

雜散光、光度噪聲、光譜帶寬等主要技術(shù)指標(biāo)差，不適合用于技術(shù)要求較高的行業(yè)，如制藥、科研、質(zhì)量檢驗(yàn)行業(yè)。 
準(zhǔn)雙光束分光光度計(jì)特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單、價(jià)格較便宜。 
有一束作為參考光束，能部分抵消光源振動(dòng)、電子學(xué)噪聲，以提高儀器的穩(wěn)定性。 
只有一個(gè)比色皿，不能抵消雜散光。
雙光束雙轉(zhuǎn)換器分光光度計(jì)特點(diǎn)：能部分抵消光源波動(dòng)、雜散光、電噪聲的影響，光度準(zhǔn)確好； 
結(jié)構(gòu)較復(fù)雜、價(jià)格昂貴； 
因一束光分為兩束，每束光的能量低，信噪比不如單光束光度計(jì)好； 
兩個(gè)轉(zhuǎn)換器不能完全匹配，故掃描測(cè)量誤差大，不建議用來(lái)做光譜掃描。
雙光束單檢測(cè)器分光光度計(jì)特點(diǎn)：能部分抵消光源波動(dòng)、雜散光、電噪聲的影響，光度準(zhǔn)確好、技術(shù)指標(biāo)很先進(jìn)； 
結(jié)構(gòu)較復(fù)雜、價(jià)格昂貴； 
因一束光分為兩束，每束光的能量低，信噪比不如單光束光度計(jì)好。但兩束光路對(duì)噪聲可相互抵消，靈敏度仍然很好。 

四、分光光度計(jì)的評(píng)價(jià)和挑選：
    適用性 
    可靠性 
    智能型 
    經(jīng)濟(jì)性 
    美學(xué)性 
    工藝性 
適    用    性：適用性—滿足使用要求的程度，主要由技術(shù)指標(biāo)所決定。 
波長(zhǎng)準(zhǔn)確度： 
對(duì)于一般的定量分析，波長(zhǎng)準(zhǔn)確度不是很重要； 
對(duì)不同試樣進(jìn)行比對(duì)測(cè)試時(shí)，波長(zhǎng)準(zhǔn)確度就相當(dāng)重要。 

雜散光： 
      在分析的試樣較多，濃度較大時(shí)很重要。 

雜散光一定時(shí)，分析測(cè)試的數(shù)據(jù)會(huì)隨著濃度的增大，偏離比耳定律的程度就越大，故對(duì)待測(cè)試樣的濃度上限有嚴(yán)格要求； 
分析品種較多的食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，必須挑選雜散光小的儀器。 

光度噪聲： 
      分析測(cè)試誤差的主要來(lái)源，且限制被分析試樣濃度的下限。 

光度噪聲一定時(shí)，濃度越低，分析測(cè)試的數(shù)據(jù)的誤差就越大，故對(duì)待測(cè)試樣的濃度下限限制較大； 
生化、海洋研究等領(lǐng)域，必須挑選光度噪聲小的儀器。 
光譜帶寬 

一般常規(guī)的在可見(jiàn)光區(qū)的分析工作，帶寬一般選擇4nm； 
用于制藥行業(yè)的藥檢，光譜帶寬在2nm或以下； 
科研工作建議選擇可調(diào)帶寬的儀器。 
可    靠    性：從狹義上講，可靠性就是儀器的故障率。 

從廣義上講，可靠性應(yīng)從分光光度計(jì)的制造和使用兩個(gè)方面衡量，包括光度準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、故障率及售后服務(wù)等內(nèi)容。 

影響可靠性的因素：首先要查看自己對(duì)儀器條件（如光譜帶寬、掃描速度、采樣間隔、標(biāo)尺設(shè)定等）的選擇是否恰當(dāng)，是否對(duì)儀器進(jìn)行了調(diào)零、基線校正、暗電流校正等； 
要嚴(yán)格檢查影響儀器光度準(zhǔn)確度的主要指標(biāo)：雜散光、光學(xué)元件（尤其是舊機(jī)器）、光度噪聲、基線平直度； 
檢查比色皿是否被污染； 
查看周圍有無(wú)干擾源，主要是電和磁的干擾； 
檢查試樣制備的過(guò)程； 
檢查試樣是否過(guò)期等等。